厌氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation，ANAMMOX)是一种环境友好的新型生物脱氮工艺，有效解决了传统生物脱氮工艺碳源需求大和能耗成本高的问题，被认为是21世纪最具发展前景的生物脱氮工艺之一。然而，作为ANAMMOX工艺的关键功能菌，厌氧氨氧化菌生长缓慢，生长速率远低于其他脱氮细菌，且对温度、pH和DO等外界环境的要求十分苛刻，使其不得不面临工艺启动困难，菌种来源匮乏等问题，极大地限制了厌氧氨氧化成为污水处理的主流工艺。ANAMMOX污泥的储存可有效保留厌氧氨氧化菌(AnAOB)，活化后的ANAMMOX储存污泥是厌氧氨氧化工艺可靠的菌种来源之一。因此，在室温条件下对厌氧氨氧化污泥进行较长时间的储存，并研究能在短期内使其脱氮活性快速恢复的方法，对厌氧氨氧化工艺的工程化应用具有重要意义。

目前厌氧氨氧化污泥的活性恢复主要面临着2个方面的问题：一是储存时间越长，污泥的脱氮性能越低，需要的恢复时间越长。黄佳路等研究发现ANAMMOX污泥的比厌氧氨氧化活性随储存时间呈近乎线性下降(r2为0.978)。二是厌氧氨氧化菌在恢复过程中容易被N2气泡携带而从反应器中洗脱，导致生物质的漂浮。有研究表明，AnAOB分泌的胞外聚合物可以使其紧密附着在生物填料上，从而有效缓解反应器内部的细胞冲刷现象，增强系统的生态稳定性和机械稳定性。然而，关于填料对长期储存后的ANAMMOX污泥活性恢复的影响研究较为稀缺。

本研究将活性良好的厌氧氨氧化污泥置于室温(15~30℃)条件下进行为期9个月的长期储存，储存过程中不提供任何微生物生长所需的基质。通过比较添加不同填料的厌氧氨氧化反应器的污泥颜色变化、脱氮效果和微生物群落特征等情况，探究长期室温储存后的厌氧氨氧化污泥的活性恢复能力，分析填料在恢复过程中发挥的作用，以期为长期室温储存后的ANAMMOX污泥的活性快速恢复提供理论依据和技术指导。

1、材料与方法

1.1 接种污泥

储存前的厌氧氨氧化污泥取自某工厂厌氧氨氧化脱氮装置，污泥浓度2250mg?L-1，呈红褐色，有良好的沉降性能和厌氧氨氧化活性。将该厌氧氨氧化污泥在室温条件下避光密封储存9个月，期间室内环境最高温度为30℃，最低温度为15℃。

污泥活性恢复前，用氨氮和亚硝态氮浓度均为10mg?L-1的培养液清洗3遍，接着将污泥粉碎，使其粒径保持在1mm左右，增大其与培养液的接触面积，强化污泥恢复过程中的生物反应。

1.2 实验用水

本实验采用人工配水，由(NH4)2SO4和NaNO2提供氮源，通过0.1mol?L-1 HCl控制pH在7.5~8.0.其他配水组分包括： ρ(NaHCO3)1250mg?L-1， ρ(MgSO4 ?7H2 O)300mg?L-1， ρ(KH2PO4)10mg?L-1， ρ(CaCl2)5.6mg?L-1，微量元素Ⅰ1mL?L-1，微量元素Ⅱ1mL?L-1.微量元素Ⅰ成分： ρ(EDTA)5000mg?L-1， ρ(FeSO4 ?7H2 O)5000mg?L-1;微量元素Ⅱ成分： ρ(EDTA)5000mg?L-1， ρ(MnCl2 ?4H2 O)990mg?L-1， ρ(CuSO4 ?5H2 O)250mg?L-1， ρ(ZnSO4 ?7H2 O)430mg?L-1， ρ(CoCl2 ?6H2 O)240mg?L-1， ρ(Na2MoO4 ?2H2 O)220mg?L-1， ρ(NiCl2 ?6H2 O)190mg?L-1， ρ(H3BO4)14mg?L-1.本实验在进水中额外投加了ρ(Ca2+)0.03mmol?L-1，以促进厌氧氨氧化菌分泌胞外聚合物，帮助受损的厌氧氨氧化菌群附着在填料上并完成再生。考虑到氮气脱氧需要配置减压阀、液氮钢瓶等相对复杂的曝气设备，每次脱氧需耗时20min左右，而采用无水Na2SO3进行化学脱氧只需搅拌15s即可达到目标脱氧效果，且化学脱氧的成本远低于氮气脱氧，故本研究采用了操作更便捷、成本更低、脱氧更快的无水亚硫酸钠还原脱氧法。本实验投加的无水Na2SO3浓度约为0.1g?L-1，结合相关文献，该SO42-浓度对微生物和基质浓度几乎不产生影响，反应式见式(1)。

活性恢复期间根据污泥脱氮效果，对进水浓度进行了3次提升，详见表1.

1.3 实验装置

本实验装置如图1所示，反应器采用有机玻璃材质，有效容积1.0L，其中，每组反应器污泥投加量为0.3L，水体体积为0.4L，容积交换率50%，水力停留时间24h。装置接口处均采用硅胶密封，以保证反应器内的厌氧环境。通过恒温水浴振荡器将装置温度控制在(35±1)℃，并以120r?min-1的频率振荡，使反应器内部培养液分布均匀。反应器外部用锡纸包裹遮光，防止藻类滋生。

如图2所示，R2和R3反应器内分别填充彗星纤维填料(比表面积1100m2 ?m-3)和K3填料(比表面积约500m2 ?m-3)作为生物载体。

1.4 检测项目与方法

NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度分别采用纳氏试剂分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法测定，总无机氮TIN=[NH4+-N]+[NO2--N]+[NO3--N]。污泥浓度采用重量法测定，pH采用便携式pH计检测。

采用16SrRNA高通量测序技术来研究厌氧氨氧化系统中的微生物多样性和群落结构。样品取自运行第35d的3组反应器中的ANAMMOX污泥。

2、结果与讨论

2.1 恢复过程中污泥的颜色变化

红色是厌氧氨氧化菌(AnAOB)最显著的特征，活性恢复过程中污泥的颜色变化见图3.厌氧氨氧化污泥在未补充基质的情况下经过9个月的室温保存，结构变得细碎，颜色发黑，散发臭味，这是由于在无基质添加的厌氧氨氧化污泥储存过程中，AnAOB的胞内血红素不断衰减，同时由于菌体死亡水解，黑色硫化物的含量增加，最终逐渐覆盖住污泥原本的红色外观，使污泥呈现黑色。经过42d的运行，AnAOB利用包括细胞色素c在内的多种蛋白质，完成菌体的生长、繁殖和代谢，厌氧氨氧化活性明显提高。R2和R3反应器中可看到明显的红色颗粒污泥以及红色生物膜，而R1反应器中的污泥总体颜色较恢复前虽然发生了变化，但几乎看不到红色颗粒污泥。Kang等的研究发现色度与比厌氧氨氧化活性显著相关(r=0.940)，可以作为一种直观的厌氧氨氧化活性指标。在本研究中，R2和R3反应器内的厌氧氨氧化活性显然更高。

2.2 活性恢复过程中污泥的脱氮效果

2.2.1 启动阶段

本研究采用低氮进水和较长水力停留时间来启动恢复实验，待污泥脱氮性能逐渐恢复后，再逐步提高进水基质浓度，提升系统脱氮负荷。各阶段污泥脱氮效果和化学计量比变化见图4.根据ANAMMOX反应的化学方程式，本实验各阶段进水NH4+-N和NO2--N的化学计量比均采用1∶1.32.

第Ⅰ阶段(1~10d)，进水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分别为50mg?L-1和66mg?L-1，水力停留时间HRT设定为24h。3组反应器经过短暂的适应之后脱氮性能均有提升，但处理效果不够稳定，化学计量比波动较大。由图4(d)可知，R2和R3反应器的氮去除效果明显优于R1反应器。Zhang等的研究发现填料可以为微生物生长提供不同的生态位，实现氨氧化菌(AOB)和AnAOB等不同菌种的协同脱氮，故R2和R3反应器获得了更高的氮去除率。在第8d和第10d时，R2和R3反应器内的NH4+-N和NO2--N同步去除率均达到90%以上，系统开始出现ANAMMOX反应，TIN去除率分别达82.25%和80.92%，R2反应器的脱氮性能略优于R3反应器。江宇勤等的研究指出生物膜的质量会受到载体的比表面积、生物亲和性和表面粗糙度等理化性质的影响。相比于K3填料，彗星纤维填料具有更大的比表面积，且表面亲和性更强，有利于微生物附着，故R2反应器的脱氮性能更佳。

第Ⅱ阶段(11~15d)，考虑到恢复初期反应器运行效果不稳定，易因为氮负荷的过大波动而造成基质浓度抑制现象，第Ⅱ阶段对进水基质浓度进行了小幅提升， ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分别提高到80mg?L-1和105.6mg?L-1.图4(e)显示，该阶段未添加填料的R1反应器的化学计量比与理论值相差最大，且波动最为明显，原因系R1反应器中的AnAOB活性仍较低，尚未占据主导地位。

2.2.2 负荷提高和稳定运行阶段

随着ANAMMOX污泥脱氮性能的逐渐恢复，第Ⅲ阶段(16~25d)，进水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分别调整为200mg?L-1和264mg?L-1，水力停留时间HRT为24h。图4(a)和图4(b)显示，氮负荷的大幅提高使3组反应器的氮去除效果均受到影响而降低，但与R1相比，R2和R3反应器受到的波动要小得多，添加填料的ANAMMOX反应器具有更强的生态稳定性和耐冲击负荷能力。

为了进一步考察3组ANAMMOX反应器的脱氮稳定性，第Ⅳ阶段(26~42d)，进水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)进一步提高到300mg?L-1和396mg?L-1。由图4(d)和图4(e)可知，与前几个阶段相比，第Ⅳ阶段中3组反应器的TIN去除率波动幅度明显减小，化学计量比逐渐趋近理论值(NO2--N/NH4+-N等于1.32，NO3--N/NH4+-N等于0.26)，ANAMMOX系统开始进入稳定运行阶段。3组反应器经过42d的运行，脱氮性能均得到有效提升，TIN去除率分别达78.96%、84.92%和84.66%，NO2--N/NH4+-N分别为1.43、1.35和1.34，略高于理论值1.32，NO3--N/NH4+-N分别为0.21、0.24和0.23，略低于理论值0.26.王贤等的研究指出，不同反应装置的化学计量比往往因为反应器类型、菌种的结构和状态，所处环境条件不同而存在差异。一个良好的ANAMMOX系统往往是多菌种共同协作的脱氮过程，本实验除了存在氨氧化菌(AOB)将NH4+-N转化成NO2--N外，还存在部分反硝化菌将NO3--N转化为NO2--N，使系统出现NO3--N/NH4+-N略低于理论值，而NO2--N/NH4+-N略高于理论值的现象。结果显示，R2和R3反应器的TIN去除率显著优于R1反应器，在长期室温储存的ANAMMOX污泥的活性恢复过程中，填料可以为微生物提供更加稳定的生长环境，增强ANAMMOX污泥抵抗不利环境的能力，提高ANAMMOX系统的脱氮稳定性。

2.3 微生物群落特征分析

2.3.1 门分类水平上菌群结构分析

图5所示的是3组反应器在门水平上的微生物群落结构，优势菌门(相对丰度>5%)为Proteobacteria(变形菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Planctomycetes(浮霉菌门)和Patescibacteria。AnAOB是化能自养型细菌，目前发现的AnAOB均属于浮霉菌门，R1、R2和R3反应器中的浮霉菌门占比分别为3.79%、8.71%和8.86%。刘冰等的研究发现填料的理化特性可显著影响脱氮功能菌(尤其是AnAOB)的富集效果及活性，添加填料的R2和R3反应器获得了更高的浮霉菌门丰度。

此外，在3组反应器中，变形菌门(Proteobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)均占据了很大的比例(图6)，这与多数研究中的厌氧氨氧化系统菌群分布相一致。变形菌门与脱氮过程密切相关，在厌氧氨氧化系统中广泛存在，包括氨氧化细菌(AOB)和亚硝酸盐氧化菌(NOB)在内的多种微生物都属于变形菌门，参与脱氮及许多污染物的降解过程。绿弯菌门常在自养脱氮系统中被发现，是起骨架和载体作用的重要伴生功能菌，在ANAMMOX系统中扮演着重要角色。

2.3.2 属分类水平上菌群结构分析

考察3组反应器在属水平上的微生物群落结构，并进行分析，不同ANAMMOX反应器中的AnAOB丰度及其在浮霉菌门中的占比见表2.热图可以通过可视化的方法直观地反映微生物的群落组成，污泥样品中相对丰度排名前25的属的分布热图见图7.测序结果表明，污泥样品中典型的ANAMMOX菌属为CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia，其中， CandidatusJettenia在3组反应器中的相对丰度分别为1.62%、5.74%和5.21%，其在R2反应器中的相对丰度最高，其次是R3反应器，添加填料的两组反应器中的CandidatusJettenia的相对丰度是空白对照组的3~4倍。 CandidatusBrocadia在3组反应器中的相对丰度均较低，分别为0.57%、1.11%和0.85%。总体来看，R1、R2和R3反应器中的AnAOB在浮霉菌门中的占比分别为57.78%、78.65%和68.40%。可以发现，填料的加入促进了AnAOB在浮霉菌门中占据主导地位，使优势菌属更为凸显。

2.4 厌氧氨氧化生物膜生长和颗粒污泥形成机制

一个良好的ANAMMOX系统中氮的去除往往是以AnAOB为主导功能菌，多种脱氮细菌综合作用的结果，好氧菌和异养菌为AnAOB提供了基质和生存环境。R2和R3反应器中的ANAMMOX生物膜如图8所示。

R2和R3反应器中的颗粒污泥主要是通过生物膜分离形成的，可能的颗粒化过程如图9所示。生物膜的形成是一个动态的过程，包括初始生物量的积累(微生物附着)、发育(生长)和末端生物量的积累(成熟)。最初，悬浮污泥首先吸附在填料上，逐渐生长形成生物膜，这时的生物膜主要由好氧氨氧化菌(AOB)和异养反硝化菌(DEN)组成。待好氧菌把氧气消耗后，生物膜内部出现缺氧区，为AnAOB的生存提供了有利条件，生物膜上的AnAOB数量逐渐增多。

胞外聚合物(EPS)是形成生物膜的重要条件，李鸿江等的研究发现AnAOB分泌的胞外聚合物含量要高于AOB，故其在填料上的挂膜效果显著优于AOB。因此，在良好的生存环境下，AnAOB利用氮素实现自身新陈代谢和生长繁殖，菌体数量得以增长，逐渐在填料上形成一层ANAMMOX生物膜并变厚。在机械振荡和水力剪切作用下，部分厌氧氨氧化聚集体从过厚的生物膜外侧分离出来，逐渐形成颗粒污泥，进行菌体的分裂繁殖，实现CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia数量的成倍增长，生物膜上的AnAOB的相对丰度是空白对照组的2~4倍。

3、结论

(1)投加填料构建厌氧氨氧化生物膜-颗粒污泥复合系统，可以有效提高室温下储存9个月的ANAMMOX污泥的活性恢复速率，投加填料的2组ANAMMOX反应器的AnAOB相对丰度是空白对照组的2~4倍，填料有效提高了反应器中的AnAOB的相对丰度，且彗星纤维填料的促进作用略优于K3填料。

(2)在厌氧氨氧化污泥的活性恢复过程中，填料可以提高ANAMMOX污泥的耐冲击负荷能力，提高系统的生态稳定性和脱氮稳定性。（来源：中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室，中国环境科学研究院国家环境保护地下水污染模拟与控制重点实验室）